14.05.2020

Projet LuLISA : la bioluminescence pour l’aide au diagnostic, de l’allergie jusqu'au Covid-19

Sommaire

Le projet de recherche LuLISA consiste à développer des tests sérologiques à forte sensibilité, adapté au haut débit pour des études et des suivis épidémiologiques de cohortes locales, régionales ou nationales. Dans une publication scientifique qui vient de sortir, l’application du LuLISA au dosage des IgE spécifiques d’allergènes dans le sérum de patients allergiques a montré une sensibilité très largement supérieure aux kits et systèmes commerciaux. Le LuLISA est adapté à la détection des anticorps dirigés contre les protéines du coronavirus SARS-CoV-2. Il est actuellement utilisé à l’Institut Pasteur comme une des méthodes de référence pour suivre la progression de l’immunité collective contre la maladie Covid-19 en collaboration avec Santé publique France et plusieurs hôpitaux dans différents départements en France. Ce projet associe des chercheurs de l’Institut Pasteur (départements d’Immunologie et de Biologie structurale et chimie), du CNRS (UMR3523) et de l’Inserm (U1221, U1222, UMR1043) dans le développement d’une nouvelle méthode de dosage1 de type ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Le LuLISA (Luciferase-Linked ImmunoSorbent Assay) repose sur la production d’une protéine qui exprime en tandem un fragment d’anticorps de lama ou d’alpaga, capable de fixer une protéine spécifique (les immunoglobulines d’un patient, s’il s’agit d’une sérologie, ou des protéines virales, s’il s’agit d’une détection de virus) avec une luciférase de crevette, un enzyme capable d’émettre très efficacement de la lumière en présence d’un substrat de synthèse. La quantité de lumière (photons par seconde) émise est proportionnelle à la quantité d’anticorps de lama fixée. Le LuLISA quantifie donc les immunoglobulines de patient, ou de protéines virales associées à leurs cibles spécifiques immobilisées pour les piéger au fond d’un tube, d’un puits de plaque, une bandelette ou sur une microbille. Le LuLISA mesure une vitesse de réaction indiquée par le nombre de photons détectés par seconde et diffère des ELISA qui mesurent l’accumulation d’un produit de réaction coloré ou fluorescent.

Test - LuLISA - Institut Pasteur

Le LuLISA quantifie les immunoglobulines de patient, ou de protéines virales associées à leurs cibles spécifiques immobilisées pour les piéger au fond d’un tube, par exemple. Crédit : Institut Pasteur

 

Un test sérologique pour doser les IgE associées aux allergies

Appliqué aux tests sérologiques, le LuLISA permet d’augmenter la sensibilité de détection des immunoglobulines spécifiques, de 100 à 1000 fois par rapport aux ELISA, sur une échelle de concentration de 4 à 5 ordres de grandeur au lieu de 2. Il se prête au dosage quantitatif de routine (1h) ou en urgence (5 min). Il s’adapte aussi bien au haut débit automatisé sur plaques à puits multiples, comme à l’autotest manuel sur bandelette pour un coût en réactifs de quelques centimes par test.

Dr Laurent Reber, chercheur Inserm, immunologiste à l’Institut Pasteur (unité Anticorps en thérapie et pathologie au sein du département d’Immunologie de l’Institut Pasteur, et Inserm U1222) et au Centre de physiopathologie de Toulouse-Purpan (ATIP-Avenir team "Asthma, Allergy & Immunotherapy" Inserm UMR1043) a guidé l’application du LuLISA au dosage des IgE spécifiques d’allergènes dans le sérum de patients allergiques avec une sensibilité très largement supérieure aux kits et systèmes commerciaux1. Cela pourrait permettre de mieux détecter les causes d’allergie et de se rapprocher des sensibilités des tests cutanés et proposer une alternative sans risque d’irritation ou de surinfection.

Lire la publication scientifique publiée en mai 2020 dans la revue Allergy

La bioluminescence venue du fond des océans

Les luciférases sont des enzymes fréquents dans les espèces marines des abysses (diatomées, cnidaires, méduses, crevettes, poissons), plus rares dans les espèces terrestres (lucioles, scarabées, larves de moustiques, champignons). De nouvelles luciférases sont découvertes régulièrement et certaines produisent des émissions lumineuses plus intenses souvent bleues quelques fois vertes, oranges ou rouges, lorsqu’elles sont associées à des protéines fluorescentes. Les luciférases connues produisant le plus grand nombre de photons par seconde sont celles dérivées de crevettes des abysses, Gaussia princeps, et plus récemment Oplophorus gracilirostris. L’utilisation des luciférases est répandue dans les laboratoires de recherche mais encore rare dans les applications diagnostiques. Les substrats de synthèse restent trop chers pour des utilisations industrielles et malgré la réduction de l’enzyme au seul domaine catalytique et l’optimisation de son activité, l’enzyme reste fragile, s’autodétruit et à tendance à s’adsorber aux surfaces.

La spécificité du test issue de l’altiplano andin

Le point critique du LuLISA est l’affinité de l’anticorps ou plus généralement du « protein-binder » pour la protéine cible spécifique choisie pour le diagnostic. Une large variété de protein-binders est utilisable. Pour nos applications actuelles, les anticorps monocaténaires de lama et d’alpaga ont été retenus. Les fragments réduits à partie variable des simples chaines lourdes d’immunoglobulines communes aux camélidés, appelé VHH ou nanobody (petites protéines de 14kDa) sont sélectionnés par criblage de librairies de VHH issues d’animaux immunisés avec la protéine à quantifier et exprimés à la surface de phages M13. Les affinités des VHH recherchés sont très élevées, de l’ordre du nanomolaire. Plus leur affinité sera forte, plus le test sera sensible. Des collaborations ont été entreprises avec la Plateforme d’Ingénierie des Anticorps de l’Institut Pasteur (Dr Pierre Lafaye) pour sélectionner des VHH issus d’immunisation d’alpagas, et avec la Plateforme de production d’Anticorps Recombinants de l’Institut Curie (Dr Frank Perez, Dr Sandrine Moutel, CNRS UMR144) pour sélectionner des VHH issus de libraires de synthèse.

Deux verrous à lever pour passer de la recherche à la santé publique

Dr Sophie Goyard, chercheuse à l’Institut Pasteur, biologiste moléculaire dans l’unité de Biologie cellulaire des lymphocytes (Institut Pasteur département d’Immunologie, Inserm U1221), développe depuis 20 ans des assemblages de protéines bioluminescentes pour des applications en imagerie cellulaire in vitro ou in vivo et depuis deux ans pour des applications diagnostiques. Par mutagénèse dirigée, elle a augmenté l’activité de la luciférase plus de 10 fois et réduit de moitié sa tendance à l’adsorption et amélioré ainsi 20 fois le ratio signal sur bruit par rapport aux luciférases commercialisées les plus performantes. C’est la première barrière nécessaire à franchir pour donner la sensibilité au dosage en plaque nécessaire aux laboratoires d’analyse médicale et permettre l’utilisation de lecteurs nomades de bioluminescence pour des applications au cabinet du médecin ou les dispensaires. Cela lui a permis de concevoir les constructions de VHH-luciférase à la base du LuLISA.

Ces cinq dernières années, le Dr Yves Janin, directeur de recherche au CNRS, chimiste médicinal rattaché à l’unité de Chimie et biocatalyse de l’Institut Pasteur (département de Biologie structurale et chimie de l’Institut Pasteur, et UMR CNRS 3523), a dirigé avec son groupe la recherche de nouvelles voies de synthèse des substrats7,8, les luciférines, pour en faire baisser le coût, le second verrou pour les applications d’envergure. Ce groupe a aussi découvert une solution pour les rendre stables pendant des mois à température ambiante sous la forme de pro-substrats O-acétylés. Plus de 185 analogues de la luciférine naturelle, la coelenterazine, ont ainsi été synthétisés et nous disposons aujourd’hui de substrats produisant des émissions plus intenses (flash) ou plus longues et constantes (glow). Ces substrats répondent à des applications différentes9. Les longueurs d’ondes d’émission varient peu autour du bleu (460 nm), mais les spectres peuvent être si larges que même dans le rouge, il reste de 2 à 10% de l’intensité maximale ce qui autorise des applications en imagerie des tissus ou des animaux vivants. L’hikarazine-108 (Q108), a été sélectionnée parmi les analogues de synthèse de luciférine pour les applications diagnostiques. Dans le cadre de ce projet, 20 grammes de Q108 ont été produits, assez pour 60 millions de tests sérologiques. De telles quantités de production ouvrent l’usage de la bioluminescence à des criblages à haut débit, la cartographie d’interactomes10 ou des études épidémiologiques sur de larges populations.

Le test LuLISA pour la maladie Covid-19

Initié pour mesurer des marqueurs de l’allergie1, puis amélioré pour détecter des marqueurs tumoraux faibles, le LuLISA est adapté dans ce projet à la détection des anticorps (immunoglobulines IgG, IgM, IgA, IgE) dirigés contre les protéines du coronavirus SARS-CoV-2 responsable de la maladie Covid-19. La nucléoprotéine et la spicule du virus ont été choisies comme cibles des tests. Elles sont produites par la plateforme technologique Production et purification de protéines recombinantes dirigée par Dr Stéphane Pètres à partir des vecteurs conçus par Dr Nicolas Escriou et son groupe au laboratoire d’innovation Vaccins. Ces tests sérologiques permettent de suivre sur des cohortes locales, régionales ou nationales, la progression de l’immunité collective en France.

Les performances remarquables du LuLISA permettent de réduire à moins d’un microlitre le volume de sérum sanguin nécessaire pour détecter les anticorps spécifiques d’antigènes, les protéines de la capside du virus SARS-CoV-2 par exemple. Ceci permet d’identifier si un patient à fait une réponse immune à l’infection, en général quelques jours après les éventuels premiers symptômes. Ces tests sont actuellement utilisés à l’Institut Pasteur par le Centre national de référence des Virus des infections respiratoires dirigé par la Professeure Sylvie van der Werf. Des milliers de prélèvements sanguins issus de multiples cohortes permettent d’évaluer, à travers des échantillons représentatifs de différentes populations plus ou moins exposées au virus, quelle proportion de personnes a été infectée et a développé des immunoglobulines G et M contre les protéines du virus. La progression de cette proportion dans la population est suivie en répétant ces tests tous les mois depuis fin mars à la demande de Santé publique France pour évaluer le niveau de l’immunité collective.

Un test sérologique pour doser les IgE associées aux allergies

Dr Laurent Reber, chercheur Inserm, immunologiste à l’Institut Pasteur (unité Anticorps en thérapie et pathologie au sein du département d’Immunologie de l’Institut Pasteur, et Inserm U1222) et au Centre de physiopathologie de Toulouse-Purpan (ATIP-Avenir team "Asthma, Allergy & Immunotherapy" Inserm UMR1043) a guidé l’application du LuLISA au dosage des IgE spécifiques d’allergènes dans le sérum de patients allergiques avec une sensibilité très largement supérieure aux kits et systèmes commerciaux1. Cela pourrait permettre de mieux détecter les causes d’allergie et de se rapprocher des sensibilités des tests cutanés et proposer une alternative sans risque d’irritation ou de surinfection.

Lire la publication scientifique publiée en mai 2020 dans la revue Allergy

Une méthode très sensible, déployable facilement et à grande échelle

La méthode1 LuLISA peut être déclinée pour différentes applications au-delà de la sérologie, aux autres fluides, pour détecter et quantifier différents types de marqueurs, pas seulement des protéines, dès que l’on dispose d’un binder qui peut s’y associer et qu’on l’exprime en tandem avec une luciférase optimisée, affublée d’étiquettes de purification ou de contrôle pour des applications à faible coût et à grande échelle. Plus l’affinité du protein-binder pour une protéine spécifique est élevée plus la sensibilité du test sera forte (1pM<Kd<10nM). La détection peut se faire avec un luminomètre à diode à avalanche, photo-multiplicateur, caméra EMCCD ou cMOS. Les applications pour smartphone haut de gamme sont ainsi envisagées. L’utilisation est déployable en format plaque à puits multiples, en tube, en support semi-sec type bandelette ou en flux dans un canal milli, micro ou nanofluidique. Le choix du couple luciférase/substrat doit être adapté en fonction de la technologie, du format et du temps de lecture de la bioluminescence. La calibration est faite avec une gamme de concentrations de marqueurs de référence qui assure la reproductibilité et la fiabilité du test pour une utilisation diagnostique.

 

Test - LuLISA - Institut Pasteur

La détection du signal peut être réalisée avec différents types de luminomètres équipés ici d'un photomultiplicateur. Crédit : Institut Pasteur

 

Ce projet a bénéficié du soutien de l’Agence nationale pour la recherche (ANR)2, de l’Institut Pasteur3 (et sa direction de des applications de la recherche et des relations industrielles), de l’Inserm4, de la Fondation Roquette pour la Santé, et de la générosité du public et d’entreprises5 et le soutien technique de de la société Berthold Technologies. L’Institut Pasteur a déposé une demande de brevet pour le LuLISA6.

1. Goyard S, Balbino B, Chinthrajah RS, Lyu S-C, Janin YL, Bruhns P, Poncet P, Galli SJ, Nadeau KC, Reber LL, Rose T. A highly sensitive bioluminescent method for measuring allergen-specific IgE in microliter samples.  Allergy, European Journal of Allergy and Clinical Immunology, mai 2020. DOI:10.1111/all.14365.
2. Grant ANR-11-CRNT-0004, programme Global-Care, Institut Carnot-Pasteur « Maladie Infectieuses »
3. Valoexpress (2016-2018), IARP-Soutien à l’innovation (2019-2020), DARRI, Institut Pasteur
4. INSERM, programme ATIP-Avenir
5. Campagne d’appel à dons ciblé « Urgence Coronavirus » pour soutenir les recherches de l’Institut Pasteur.
6. Rose, T.; Goyard, S.; Reber, L. L.; Janin, Y. L. Luciferase linked immunosorbent assay. Filing date: 27/04/2020, 2020.
7.Janin, Y. L.; Coutant, E. P.; Hervin, V.; Gagnot, G.; Jacob, Y.; Goyard, S.; Rose, T. Imidazopyrazine derivatives, process for preparation therof and their uses as luciferins. WO 2018197727, 2018.
8. Coutant, E. P.; Goyard, S.; Hervin, V. O.; Gagnot, G.; Baatallah, R.; Rose, T.; Jacob, Y.; Janin, Y. L., Gram-scale synthesis of luciferins derived from coelenterazine and original insights in their bioluminescence properties. Org. Biomol. Chem. 2019, 17, 3709-3713.
9. Coutant, E. P.; Gagnot, G.; Hervin, V. O.; Baatallah, R.; Goyard, S.; Jacob, Y.; Rose, T.; Janin, Y. L., Bioluminescence Profiling of NanoKAZ/NanoLuc Luciferase Using a Chemical Library of Coelenterazine Analogues. Chemistry 2020, 26, 948-958.
10. Choi, S. G.; Olivet, J.; Cassonnet, P.; Vidalain, P. O.; Luck, K.; Lambourne, L.; Spirohn, K.; Lemmens, I.; Dos Santos, M.; Demeret, C.; Jones, L.; Rangarajan, S.; Bian, W.; Coutant, E. P.; Janin, Y. L.; van der Werf, S.; Trepte, P.; Wanker, E. E.; De Las Rivas, J.; Tavernier, J.; Twizere, J. C.; Hao, T.; Hill, D. E.; Vidal, M.; Calderwood, M. A.; Jacob, Y., Maximizing binary interactome mapping with a minimal number of assays. Nat. Commun. 2019, 10, 3907-.

 

Source

Lire l'article publié le 14/05/2020 sur le site de l'Institut Pasteur